卡西波肉瘤相關的皰疹病毒感染間充質干細胞分化組織表現出明顯的血管生成、侵襲等現象
卡西波肉瘤是一種發生在包括口腔在內的多種組織內的，具有強的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤。卡西波肉瘤KS已經被鑒定出多種細胞標記物，但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發現卡西波肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）能夠使大鼠的原代間充質干細胞（MSCs）感染，變形，并且重新編輯，使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中，科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質干細胞，包括骨髓（MSCbm），脂肪組織（MSCa），牙髓，牙齦組織（GMSC），和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的穩定株。其中，這些細胞表達了混合的KS標記物，并且顯現出不同的血管生成、侵襲和變形的現象，而LTC-KMSCs表現出比未感染細胞更低的增殖率。進而研究人員發現KSHV介導的血管生成是通過KSHV介導的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明，在人體內MSCs是KSHV的靶細胞，會建立起多種KSHV感染的模型。
研究人員采用各種MSCs，鋪在基質膠上，孵育8小時，對比不同細胞的分枝數和節點數。
Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857
（一）實驗材料和實驗方法
1）細胞： MSCs ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)
2）培養基： MSC medium (MSCM; ScienCell Research Laboratories)
3）基質膠： Matrigel Basement membrane (BD) 10 µl per well
4）耗材： ibidi血管生成載玻片 (ibidi, 81506)
5）其他： 細格紙
（二）實驗步驟
1）準備基質膠
① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中，注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。
② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③ 準備一個10cm的培養皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。
⑤ 37℃至少孵育30分鐘，使基質膠完全固化。
怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態。
3）鋪細胞
① 每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。
② 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
③ 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養基，使上孔液體正好加滿。
⑤ 蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4）采集圖像并統計結果
37度 5% CO2孵育8小時后，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數和節點數進行測量和統計。
三）實驗結果
對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質干細胞，KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集，100倍放大倍數。
(A)為了研究KSHV相關的miRNA的作用，對比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10個pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩轉的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉錄病毒重新表達這10個miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細胞的血管生成。發現這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強。兩組結果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數采集圖像。
滬公網安備31011202005471 
