ibidi為腫瘤相關(guān)研究提供解決方案！
德國易必迪ibidi公司成立于2001年，位于馬丁雷德，鄰近慕尼黑。公司自成立以來，專注于細胞培養(yǎng)及功能實驗的耗材及儀器開發(fā)（見圖1），致力于為科研工作者提供操作簡單、能夠快速獲得實驗結(jié)果的高品質(zhì)產(chǎn)品，在美國及歐美生物醫(yī)學領(lǐng)域收到歡迎，在國內(nèi)，ibidi產(chǎn)品設(shè)計及其優(yōu)良的產(chǎn)品性能也使其逐漸獲得相關(guān)科研工作者的關(guān)注與信賴。
圖1. ibidi部分產(chǎn)品展示
利用易必迪公司ibidi提供的系列產(chǎn)品，可以從細胞和分子水平上對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程進行研究。下面以研究P蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用為例，探討ibidi公司系列產(chǎn)品從免疫熒光檢測，到功能實驗測定細胞增殖、分化、凋亡、遷移及血管生成等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學行為中的應(yīng)用。
P蛋白在結(jié)腸癌病人中高表達，并且與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。對于可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用的特定蛋白分子，通過免疫熒光技術(shù)檢測其細胞內(nèi)表達及定位，通常是研究的第一步。P蛋白是一個功能未知的新蛋白，我們首先制備了分別針對N端、C端及多個功能域的抗體，通過Western blotting和免疫熒光實驗來確定其表達及在細胞內(nèi)的具體定位（圖2）。由于ibidi的m-slide所需細胞數(shù)、抗體量等都非常少，同時可以很方便地在同一片slide上進行細胞培養(yǎng)、固定、染色等操作（見圖2A），我們同批次在多個結(jié)腸癌細胞系中，利用自己制備的5個針對不同區(qū)域的抗體檢測了P蛋白的細胞內(nèi)表達及定位，發(fā)現(xiàn)P蛋白在結(jié)腸癌細胞系中普遍高表達，主要定位在細胞質(zhì)中，在細胞核周圍有聚集，核內(nèi)也有少量信號（見圖2B）。
圖2. 蛋白P的細胞內(nèi)定位。 A）實驗流程示意圖。將結(jié)腸癌細胞系Caco2按9000個細胞/孔的密度種植在ibidi的m-slide中，培養(yǎng)兩天后，在m-slide中直接固定細胞，孵育一抗（抗P蛋白）和熒光二抗，封片后在共聚焦顯微鏡下觀察。B）利用針對P蛋白不同區(qū)域的多種抗體進行免疫熒光實驗，均提示內(nèi)源P蛋白特異性地定位在細胞質(zhì)。右邊的免疫熒光圖紅色熒光顯示的是P蛋白的細胞內(nèi)定位，綠色熒光（Na-K-ATPase）顯示的是細胞膜，藍色熒光（DAPI）顯示的是細胞核。
為了進一步了解P蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的作用，我們一方面通過MTT實驗檢測抑制P蛋白對結(jié)腸癌細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 降低P蛋白的表達顯著抑制Caco2細胞的增殖，而且這種抑制作用可以被外源表達的RNAi resistant 的P蛋白所挽救（rescue）。另一方面利用經(jīng)典的傷口愈合實驗（也稱劃痕實驗）我們檢測了P蛋白的表達水平是否對細胞遷移有影響（圖3）。我們選用ibidi culture-insert產(chǎn)品代替?zhèn)鹘y(tǒng)的槍頭劃痕方法，主要是基于ibidi生物相容性硅膠制成的插件，可產(chǎn)生確定的500μm “劃痕”區(qū)域，“劃痕”區(qū)域規(guī)整，配合配套的軟件分析方便獲得可靠的統(tǒng)計結(jié)果，實驗操作簡單，而且增強了實驗的重復(fù)性（圖3A）。我們選擇了在17小時之內(nèi)的多個時間點觀察細胞的遷移情況。發(fā)現(xiàn)P蛋白的缺失對細胞遷移有明顯抑制作用（圖3B-C）。
圖3. P蛋白的缺失抑制了Caco2細胞的遷移。A）愈傷實驗流程示意圖。易必迪公司設(shè)計提供的愈傷實驗體系，有標準化的實驗流程和細胞培養(yǎng)器材：將5X104細胞種植在被culture-insert（Ibidi）分開的小室中，等細胞貼壁長滿后，去除culture-insert，讓細胞自由爬過中間的“cell free gap”（約500mm），在不同時間點鏡下觀察愈傷過程。B）顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RNAi P蛋白明顯抑制細胞的遷移，細胞層的愈傷過程受到嚴重影響。C）B圖的定量分析顯示，17小時后，對照組細胞層已經(jīng)愈合超過90%，而P蛋白RNAi的細胞覆蓋的傷口面積僅為對照組細胞的30%。
腫瘤細胞向局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的特性之一。我們利用ibidi可視化的“transwell”--ibipore 產(chǎn)品（見圖4A）檢測了P蛋白對結(jié)腸癌細胞侵襲的影響。ibipore產(chǎn)品有上下兩個獨立的通道（見圖4B），兩個通道overlap的區(qū)域由一個孔徑大小均一的玻璃網(wǎng)篩隔離開（見圖4C）。兩個通道可以分別培養(yǎng)細胞，通過兩種方式，細胞可以貼壁于玻璃網(wǎng)篩的上下兩側(cè)。在細胞侵襲實驗中（見圖4D），ibipore考慮到這一因素，采用兩側(cè)可以培養(yǎng)細胞的玻璃網(wǎng)篩的設(shè)計，可以檢測細胞向上側(cè)通道進行遷移的能力，進而巧妙的排除了重力作用對侵襲實驗的影響，而且光學成像特性好，可以實時觀察細胞的侵襲情況。配合ibidi流體剪切力系統(tǒng)以及加熱孵育系統(tǒng)，可以在流動、剪切力條件下實時的觀察細胞的侵襲以及遷移等實驗。我們采用ibipore產(chǎn)品實時觀察腫瘤細胞向上側(cè)小室侵襲的情況，發(fā)現(xiàn)P蛋白Knockdown的細胞向上側(cè)侵襲的能力顯著低于野生型細胞（數(shù)據(jù)未展示）。
圖4.可視化的細胞侵襲產(chǎn)品—ibipore。A）ibipore及ibipore玻璃膜培養(yǎng)細胞的染色結(jié)果。圖片背景為在ibipore玻璃膜上培養(yǎng)細胞的熒光染色結(jié)果，規(guī)則排布的白色圓點為玻璃膜的孔隙。B）ibipore組成示意圖，上下兩個獨立的細胞培養(yǎng)通道，中間overlap區(qū)域由孔徑大小均一的玻璃網(wǎng)篩隔離開。C）3μm孔徑玻璃網(wǎng)篩。D）細胞侵襲應(yīng)用舉例。
為了進一步驗證P蛋白在腸癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，我們構(gòu)建了P蛋白被穩(wěn)定敲除的HCT-116細胞。裸鼠成瘤實驗結(jié)果證明，P蛋白表達被抑制后，HCT-116的裸鼠成瘤能力受到非常顯著的抑制。
上述實驗結(jié)果提示P蛋白的表達與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性。為了尋找其分子機理，我們通過microarray的方法檢測P蛋白knockdown引起基因表達譜的變化，從而尋找P蛋白可能參與調(diào)控的下游基因。非常有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)P蛋白影響了一系列與增殖、趨化及血管生成相關(guān)的基因。我們選擇了改變顯著，同時與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CXCR4和VEGF-A兩個分子進一步驗證。發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細胞中抑制P蛋白的表達，會明顯降低這兩個分子在mRNA及蛋白水平的表達。
CXCR4是趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1（CXCL12）的特異受體，有報道稱其與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于P蛋白在結(jié)腸癌病人中與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，我們推測P蛋白可能通過調(diào)節(jié)CXCR4的表達而影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，因而通過趨化實驗比較了P蛋白被敲除的CaCo2細胞及相應(yīng)對照組細胞在CXCL12刺激下的遷移情況（圖5）。我們利用ibidi chemotaxis3D進行了細胞趨化實驗檢測。ibidi chemotaxis3D可以進行2D或者3D的細胞趨化實驗（將細胞種入圖5A“1”區(qū)域），在“2”“3”小室直接加入含有趨化因子的培養(yǎng)液，或者直接種入細胞，以研究細胞分泌物對“1”區(qū)域細胞的影響。1張板上3個chambers的設(shè)計方便同時進行并行的對照實驗，一次獲得實驗所需的所有結(jié)果（圖5B）。配合ibidi的活細胞加熱孵育系統(tǒng)監(jiān)測（圖5C），可以進行長時間穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)基成像。ibidi加熱孵育系統(tǒng)獨特的頂蓋玻璃蓋加熱設(shè)計，使溫度高于平板，在頂蓋和培養(yǎng)板之間形成垂直溫度梯度，有效避免培養(yǎng)液蒸發(fā)而影響細胞培養(yǎng)條件，以及培養(yǎng)皿蓋冷凝而影響顯微成像質(zhì)量等問題。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組Caco2細胞向含有CXCL12的小室方向遷移（圖5D），而P蛋白敲除的CaCo2細胞則向兩邊隨機遷移（圖5E）。
圖5. P蛋白的缺失抑制了Caco2細胞向CXCL12刺激方向遷移。A）趨化實驗設(shè)計示意圖。CaCo2細胞種植在ibidi μ-Slide Chemotaxis3D中間的“1”區(qū)域。B）實驗組的“2”中加含有CXCL12的培液，“3”中加普通培液；對照組的“2”和“3”中加同樣的培液，之后用ibidi的活細胞孵育系統(tǒng)連續(xù)觀察細胞的遷移情況。 B）Ibidi活體孵育系統(tǒng)示意圖。C）ibidi的溫控系統(tǒng)和CO2補充系統(tǒng)保證了細胞的培養(yǎng)條件可以長時期保持穩(wěn)定，孵育小室加熱的頂蓋則保證了鏡下觀察時不受冷凝水的干擾，成像質(zhì)量優(yōu)異。D）對照組Caco2細胞向含有CXCL12的小室方向遷移，而P蛋白敲除的CaCo2細胞則向兩邊隨機遷移。E）細胞趨化運動結(jié)果定量分析。利用WimTaxis Image Analysis軟件進行細胞運動軌跡追蹤、分析。
P蛋白影響的另一個分子VEGF-A與血管生成密切相關(guān)，而血管新生在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中都起著至關(guān)重要的作用。P蛋白促進成瘤，那么P蛋白是否會通過促進結(jié)腸癌細胞分泌VEGF-A，而促進腫瘤的血管新生呢？我們采用ibidi研究血管生成的產(chǎn)品進行實驗。ibidiμ-Slide Angiogenesis具有獨特的雙層孔洞設(shè)計，在圖6A圖中“黃色”孔洞加入Matrix gel,形成厚度均勻的膠平面，上層孔洞用來加入細胞培養(yǎng)液（粉色區(qū)域），所需細胞和試劑用量少。與傳統(tǒng)方法相比較（圖6B），ibidi產(chǎn)品可以輕松形成平整的膠平面，能夠?qū)⒓毎鶆虻匿佋?/span>Matrix gel上，方便觀察統(tǒng)計血管新生形成的分支點、成環(huán)數(shù)量以及細胞占據(jù)的面積等參數(shù)。而傳統(tǒng)方法往往形成凹形的膠平面，膠表面不平整，細胞分布不均勻，使得細胞成像及統(tǒng)計變得困難。而且ibidi配套開發(fā)的統(tǒng)計軟件可以解放勞動力，只要將間隔采取的圖像上傳，就可以輕松獲得統(tǒng)計結(jié)果（圖6C）。我們檢測了野生型CaCo2細胞及P蛋白敲除的CaCo2細胞的conditional media對HUVEC細胞血管生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)野生型CaCo2細胞的conditional media相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media對HUVEC細胞tube formation有明顯的促進作用（圖6D）。
圖6. Caco2細胞的conditional media對HUVEC細胞血管生成的影響。A）tube formation實驗設(shè)計示意圖。B）ibidi血管生成產(chǎn)品優(yōu)勢：與普通96孔板相比，ibidi 的“μ-Slide Angiogenesis”所需細胞和試劑量很少，且能讓所有細胞處于同一光學平面，提高成像質(zhì)量。C）利用ibidi血管生成產(chǎn)品實驗步驟簡單，配合軟件分析，輕松獲得血管新生的統(tǒng)計結(jié)果。D）HUVEC細胞種植在ibidi 的μ-Slide Angiogenesis中，加入野生型CaCo2細胞或P蛋白敲除的CaCo2細胞的conditional media，觀察細胞tube formation情況。利用ibidi的活細胞孵育系統(tǒng)連續(xù)觀察拍攝HUVEC細胞的tube formation情況，可以看到野生型CaCo2細胞的conditional media孵育的HUVEC細胞（upper pannel），相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media孵育的細胞（lower pannel），其小管形成明顯增多、密度更高。
綜述所述，我們利用易必迪ibidi公司提供的系列產(chǎn)品，借助其優(yōu)異的光學性能，標準化的實驗設(shè)計，對P蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機理進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)P蛋白在結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移、成瘤等過程中起重要作用，并進一步尋找了其下游的作用分子，驗證了P蛋白通過CXCR4和VEGF-A在細胞定向趨化和血管生成中的關(guān)鍵作用。
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