為了模擬腫瘤復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境，三維腫瘤球體模型已成為重要的體外模型系統(tǒng)。本實驗方案詳細(xì)闡述了使用ibidi µ-Slide I Luer 3D(貨號：87176)將嵌入I型膠原的腫瘤球體與內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共培養(yǎng)。該模型還可以通過灌流培養(yǎng)技術(shù)來模擬體內(nèi)生理條件，尤其適用于研究腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。
灌流共培養(yǎng)示意圖
ibidi為球狀體和類器官灌注培養(yǎng)提供各種解決方案：
關(guān)鍵詞：3D培養(yǎng)模型、腫瘤微環(huán)境、3D共培養(yǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤球狀體、腫瘤血管生成
01、實驗材料
重要提示：本方案針對MCF腫瘤細(xì)胞球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化；使用其他細(xì)胞球狀體或內(nèi)皮細(xì)胞時，請調(diào)整試劑和緩沖液。
1.1試劑和緩沖液
• 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，12203，Promocell公司）
• Tumor-Spheroids腫瘤細(xì)胞球狀體（此處使用MCF-7，CLS訂單號：Cryovial 300273，Vital：330273)
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（ECGM，Promocell，C-22010）
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基 2（ECGM 2，Promocell，C-22011）
• PBS (14190144, Gibco)
• Accutase細(xì)胞解離液（A1110501，Gibco）
• I膠原蛋白，大鼠尾，非胃蛋白酶化，5mg/ml（ibidi，50301），在17.5 mM乙酸中稀釋至4mg/ml
• 10x RPMI 1640（Sigma，R1145）
• 1x RPMI 1640（Sigma，R8758）
• 培養(yǎng)基補充劑（如 L-谷氨酰胺，視細(xì)胞類型而定）
• 1 M 超純水中的 NaOH
• 7.5%碳酸氫鈉（Sigma，S8761）
• 無菌超純水
1.2 設(shè)備與耗材
• µ-Slide I Luer 3D通道載玻片，ibiTreat 表面處理(貨號：87176)
• ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)(10902) 含一套灰色灌注管套裝(貨號：10968)
• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（超凈工作臺、細(xì)胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭、培養(yǎng)皿等）
• 倒置顯微鏡
• 冰塊和冷卻架
重要提示：為避免產(chǎn)生氣泡，灌注裝置和培養(yǎng)基的脫氣至關(guān)重要。在實驗開始前一天將以下部件放入培養(yǎng)箱中。只要不打開包裝，就能保持無菌狀態(tài)。
• 灌注裝置（在包裝內(nèi)）
• 用于細(xì)胞接種的細(xì)胞培養(yǎng)基（在小容器中加入所需體積的培養(yǎng)基，并稍微松開蓋子）
由于氣體在水和塑料中的溶解度與溫度有關(guān)，因此有必要采用這一程序。在較高溫度下，水和塑料吸收的氣體比在較低溫度下少。
02、制備含球狀體的3D凝膠
在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。
1. 取出先前生成的球狀體（例如，根據(jù)說明書使用µ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注通道載玻片）并在室溫下將其收集到層流罩下的試管中。
2. 如果凝膠基質(zhì)中需要補充劑，可將其添加到1x細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩中的冰塊上。
3. 將所有剩余成分和一個容量足以容納總凝膠體積的無菌試管放在層流罩中的冰上
4. 用移液管將除膠原蛋白和細(xì)胞懸浮液外的所有成分按表1所列順序移入試管中，并將其置于冰上。通過上下移液混合，然后放回冰上。
移取膠原凝膠的重要注意事項：
* 移取凝膠時一定要使用預(yù)冷移液器吸頭（4°C）。
* 由于膠原蛋白I凝膠基質(zhì)的粘度較高，建議在制備膠原蛋白I 膠基質(zhì)的所有步驟中都采用反向移液法。將移液器按壓至第二個壓力點，將凝膠注入整個移液器吸頭。僅在達(dá)到第一個壓力點之前分配凝膠。這樣移液器吸頭中會有殘留的凝膠需要丟棄，但體積會更加精確。另外，您也可以使用專為高粘度溶液設(shè)計的移液器。我們推薦使用Eppendorf Visco吸頭或 Gilson Microman E吸頭。
注意：即使在4°C溫度下，凝膠混合物也最多可使用5分鐘，然后會發(fā)生部分凝膠化。
5. 確保I型膠原蛋白大鼠尾在17.5 mM乙酸中稀釋至4.0 mg/ml，請查看分析證書 (CoA) ，以了解批次特定的膠原蛋白濃度。
注意：在稀釋膠原蛋白之前，必須用移液器上下移動幾次，使其充分混合，以形成均勻的溶液。
6. 將膠原蛋白加入步驟5中制備的混合物中。用移液器充分混合，同時始終將試管置于冰上。
7. 將制備好的球狀體懸液加入混合物中。盡量在50µl的體積中拾取更多的球狀體。在最后一步中，通過短渦旋混合樣品。
8. 現(xiàn)在可以將混合物移入 µ-Slide I Luer 3D中。移液過程中，請將載玻片放在冰上。
提示：為避免因冰而劃傷，請將µ-Side放入培養(yǎng)皿中，然后將帶有玻片的培養(yǎng)皿放在冰上。
使用µ-Slide I Luer 3D的實驗流程示意圖
9. 取下載玻片上側(cè)的保護(hù)膜，然后在每個孔中加入16µl含有細(xì)胞球狀體的膠原凝膠。注意避免產(chǎn)生氣泡。
10. 然后，將蓋玻片放在載玻片的粘性部分。按壓蓋玻片以確保粘合區(qū)域密封嚴(yán)實。
11. 用隨附供的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無菌，然后將裝有凝膠的載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5% CO2 ）中培養(yǎng)45分鐘，使其凝膠化。
12. 凝膠化后，使用10倍物鏡的相差顯微鏡觀察，可以看到膠原纖維。
表1.使用I型膠原蛋白和DMEM制備凝膠的移液方案，所有成分均按移液順序排列
03、接種內(nèi)皮細(xì)胞
在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。
1. 使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注時，如本文1實驗材料所述，在實驗前一天將灌流管套裝和內(nèi)皮生長培養(yǎng)基（ECGM和ECGM2）放入37°C的培養(yǎng)箱中預(yù)熱。
2. 用Accutase處理HUVEC1-2分鐘，使其脫離。
3. 收集細(xì)胞懸浮液，離心，用少量培養(yǎng)基（ECGM）稀釋后進(jìn)行計數(shù)。
4. 計數(shù)細(xì)胞，并將其調(diào)整至培養(yǎng)基中1.5×106 cells/ml的最終濃度。
5. 用生物兼容的1ml注射器將約 250µl細(xì)胞懸浮液注入通道。
6. 用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭移除Luer魯爾接頭中殘留的細(xì)胞懸液，用隨附的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無菌。
7. 將載玻片連同無菌濕巾放入培養(yǎng)皿中，然后其放入（37°C, 5% CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
04、連接ibidi泵系統(tǒng)進(jìn)行灌注
連接ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注
重要提示：內(nèi)皮生長培養(yǎng)基2含有誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和發(fā)芽的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子。
1. 在細(xì)胞培養(yǎng)期間，按照ibidi Pump System中的說明準(zhǔn)備ibidi Pump System。將ECGM2培養(yǎng)基注入儲液池。
2. 孵育2小時后，將載玻片連接灌注系統(tǒng)，并注入ECGM2培養(yǎng)基。
3. 如需進(jìn)行延時系列成像，將載玻片放入顯微鏡載物臺上的培養(yǎng)腔室（如ibidi Stage Top Incubator加熱孵育系統(tǒng))并開始延時成像。如需單幀成像，請?zhí)崆霸O(shè)置好顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時間。不成像時，將載玻片放回培養(yǎng)箱。若要進(jìn)行終點分析，請在實驗結(jié)束時固定細(xì)胞，然后繼續(xù)染色（見本文「染色」章節(jié))或執(zhí)行下游方案。
灌注培養(yǎng)條件下的延時成像實驗裝置示意圖
05、活細(xì)胞相差成像示例
相差鏡檢圖像：在基質(zhì)膠上生長的細(xì)胞球狀體(A)與接種2小時后的HUVEC細(xì)胞(B)。(C) 在灌注條件下(流速約為0.5ml/min)共同培養(yǎng)3天后的球狀體和HUVEC細(xì)胞。
06、染色
6.1 材料
• PBS (14190144, Gibco)
• 10%福爾馬林，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）
• Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體，MA5-18135 Invitrogen）
• Phalloidin-iFluor 647試劑（ab176758，Abcam ）
• 4′,6-diamidino-2-phenyl-indole （DAPI）（D9542 Sigma Aldrich）
• Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）
• 破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 加入 PBS）
• 封閉緩沖液（1% BSA + 0.2% Triton X-100 in PBS）
• 抗體稀釋緩沖液（PBS 中含 1% BSA + 0.05% Triton X-100）
• 牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G，Sigma Aldrich）
6.2 染色步驟
1. 為實驗制備充足的破膜緩沖液和封閉緩沖液。
2. 斷開載玻片與泵之間的連接。
3. 用移液器從Luer魯爾接頭處吸出細(xì)胞培養(yǎng)液。
4. 在一個Luer魯爾接頭注入200µl PBS，輕輕清洗細(xì)胞兩次，直到看到液體從另一個Luer魯爾接頭流出。
5. 用10%福爾馬林替換PBS固定細(xì)胞。首先，從Luer魯爾接頭吸去PBS，然后向Luer接頭處加入200µl福爾馬林，讓它流過載玻片的通道，然后從Luer魯爾接頭處吸去，再向Luer魯爾接頭中加入200µl福爾馬林，并孵育細(xì)胞15分鐘。
6. 吸去福爾馬林，用100µl PBS沖洗細(xì)胞四次。
7. 將細(xì)胞放入200µl破膜緩沖液中孵育10分鐘（與步驟5一樣，用破膜緩沖液替換PBS）。
8. 去除破膜緩沖液，用200µl PBS沖洗細(xì)胞兩次。
9. 用200µl封閉緩沖液封閉30分鐘（與使用福爾馬林時一樣，用封閉緩沖液替換PBS）。
10. 在封閉期間，制備充足的抗體稀釋緩沖液來稀釋一抗和二抗。
11. 用抗體稀釋緩沖液稀釋標(biāo)記抗體（或一抗）（1:100稀釋度）。
12. 用200µl一抗溶液替換封閉緩沖液，然后在4°C孵育細(xì)胞過夜。
13. 在接下來的所有步驟中，應(yīng)盡可能將樣品置于暗處，以避免光漂白效應(yīng)。
14. 用200µl封閉緩沖液清洗三次。
15. 在相同的抗體（Phalloidin 647 Conjugate 1:1000 稀釋, DAPI 10 µg/ml）中稀釋（第二抗體和）Phalloidiin和DAPI。
16. 用200µl的二次染色液替換封閉緩沖液，并在暗處孵育2小時。
17. 用200µl封閉緩沖液清洗三次。
18. 用PBS替換封閉緩沖液（每個通道200µl）
19. 將載玻片置于4°C黑暗處保存，直至鏡檢。理想情況下，應(yīng)立即進(jìn)行成像，因為存放時間過長會降低成像質(zhì)量。
在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動蛋白絲：Phalloidin iFluor 647（紅色），CD31（HUVEC特異性標(biāo)記）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色）
滬公網(wǎng)安備31011202005471 
